空气负氧离子抑制肝癌细胞的实验研究-金尊国际

空气负氧离子抑制肝癌细胞的实验研究

—关于森肽基生态级负氧离子生成机的实验研究

陶名章^1*，李慧²，陈少周³，李海涛⁴

（1．中国空气负离子暨臭氧研究学会，广州510300；2. 南方医科大学附属南方医院呼吸睡眠中心，广州510516;3.香港玛丽医院精神科，香港999077；4.中山大学附属第一医院神经内科，广州510080）

【摘要】目的 研究空气负氧离子对肝癌hepa1-6细胞生物活性的影响。方法 把细胞随机分为3组：空白对照组，空气对照组和负氧离子治疗组。治疗组根据负氧离子作用时间分为1h组、2h组和4h组。对细胞进行tunel染色检测凋亡情况，流式细胞仪检测细胞周期变化情况，以westernblot法检测磷酸化p38mapk的表达变化。结果 与空白对照组和空气对照组比较, 空气负氧离子治疗组肝癌细胞凋亡率明显增加,处于s期肝癌细胞所占有的比例下降明显, 磷酸化p38mapk 表达上升明显, 差异均具有统计学意义(p < 0.05)。结论 空气负氧离子通过阻滞细胞周期使肿瘤细胞发生凋亡, 进而抑制肿瘤细胞，该效应是通过p38mapk信号通路传导来实现的。

【关键词】空气负氧离子，空气负离子，肝癌，p38mapk

study of negative oxygen ions inhibiting liver cancer cells in vitro

tao ming-zhang¹，li hui²,chen shao-zhou³,li hai-tao⁴

(1.china on negative air ions and ozone reseach society，guangzhou 510300，china；2. center of respiration and sleep，nanfang hospital affiliated nanfang medical college，guangzhou 510516，china；3. department of psychiatry，hongkong queen mary hospital，hongkong 999077，china；4. department of neurology，first hospital affiliated sun yat-sen university，guangzhou 510080，china )

【abstract】objective：to investigate the affect on the biologic activity of hepatoma hepa1-6 cell line of negative oxygen ions in vitro. methods dividing the cell into three groups: negative control group, air control

group and treatment group，randomly.dividing the treatment group into 1h、2h and 4h group according to action time of negative oxygen ions, all the cells in each group were detected apoptosis and cell cycle with flow cytometry method, the phospho- p38mapk expression was detected.

by westernblot assay. results：the apoptosis rate increased, the proportion of s stage cell decreased and the expression of phospho- p38mapk increase obviously vs negative and air control group, the difference show significance ( p < 0.05).

conclusion：the negative oxygen ions can induce hepatoma hepa1-6 cell apoptosis through arresting the cell cycle, such effect was mediated by p38mapk pathway.

key words: negative oxygen ions; negative air ions; hepatoma; p38mapk

被誉为空气维生素的空气负氧离子对人体健康十分有益。研究表明，它能有效调整大脑皮层的功能，有镇静、催眠及降血压作用；它能使支气管平滑肌松弛，解除其痉挛，有效缓解哮喘；它还可以降低血脂水平，提高机体免疫力及抗肿瘤作用等^[1-4]。目前大多数研究集中于流行病学方面的研究，而对于抗肿瘤和及其作用机理的研究很少。本实验就空气负氧离子对体外肝癌细胞的影响进行了系列研究。

1. 材料与方法

1.1 材料

肝癌细胞株hepa1-6（上海艾研生物科技有限公司）；碘化丙啶（美国sigma 公司）；tunel细胞凋亡检测试剂盒（德国boehringer mannheim公司）；鼠抗人单克隆抗体p38mapk和p38mapk 特异性抑制剂sb203580（美国on-cogene公司），sb203580 使用终浓度为50μmol/l；森肽基生态级负氧离子生成机（济南新活电器公司）；model ic-2000型空气负离子检测器（瑞典，空气负离子检测装置）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

把处于对数生长期的肝癌细胞hepa1-6随机分成3组, 即空白对照组、空气对照组及负氧离子治疗组。治疗组根据空气负离子作用时间分成1h组、2h组和4h组。对照组处理：孵箱中给予普通空气；空气负氧离子组：将孵箱改造成相对密闭的空间,通过自制的装置输入由森肽基生态级负氧离子生成机产生的空气负氧离子,同时应用空气离子检测器来检测空气负离子浓度, 在实验前保证空气负氧离子浓度不高于500 /cm3,电离后维持空气负氧离子浓度在( 2- 3)×106 /cm3。

1.2.2 tunel染色

胰蛋白酶消化5-10代肝癌细胞, 制成密度为10⁵/ml左右的细胞悬液。加细胞悬液于盖玻片上, 4h后细胞贴壁, 添加培养基。待细胞生长达50%-60%, 用无血清dmem 培养液洗2次, 再加条件培养液, 继续培养48h, 收集盖玻片并应用4% 多聚甲醛固定,爬片制作成功后按照以下步骤染色: ⑴梯度乙醇水化; ⑵3ml/l h₂o₂封闭30min; ⑶20mg/l蛋白酶k消化液作用20min; ⑷tunel反应液, 37℃孵育60min; ⑸过氧化物酶连接的抗荧光素抗体, 37℃孵育30min;注意：以上2-5步以后均以10mmol/l pbs( ph7.4)轻轻振洗3次, 每次5min; ⑹dab 显色, 苏木素复染, 脱水透明, 封片。以pbs 替代tunel反应液作阴性对照, 阳性对照爬片经dnaseⅰ预处理10min, 再接tunel染色步骤。结果判定: 光镜下观察tunel染色爬片的显色反应, 数5个以上高倍视野, 不少于1000个细胞, 重复5次。细胞核中有棕黄色颗粒者为tunel阳性细胞, 即凋亡细胞。记数阳性细胞数并以百分数表示, 作为细胞凋亡指数。

1.2.3 应用流式细胞仪进行细胞周期分析 收集消化的贴壁细胞, pbs 冲洗后重悬在4℃、70%的乙醇中1-2h, 以1000r/min离心细胞后重悬在含100mg/l rna 酶和10mg /l碘化丙啶的pbs中,在25℃避光孵育15min。用facscalibur流式细胞仪进行单色荧光细胞流式计数。结果用multiplus software软件分析数据, 每个样本收集10000个细胞, 重复3次。

1.2.4 westernblot方法检测空气负离子作用前后磷酸化p38mapk 的蛋白表达 取体外培养的10⁷~10⁸个hepa1-6细胞在1ml ripa裂解缓冲液中匀浆提取蛋白, 测定提取的蛋白浓度。每个上样孔加样30μg蛋白, 经电泳、转膜后杂交, 一抗为山羊抗人磷酸化p38mapk单抗( santa cruz公司, 1：400), 二抗为hrp标记兔抗山羊igg抗体( santa cruz公司, 1：4000) , ecl显色( amersham公司) , 拍照, 密度扫描测各条带吸光度( ia )。以ia (目的条带/β-actin对照条带) , 表达各标本上述蛋白含量, 重复10次。

1.3 统计学处理 采用spss13.0软件进行统计学分析, 计量资料用( ±s)表示, 采用t检验。

2. 结果

凋亡率、s期占有率及p38mapk的ia值详见下表。

表1 凋亡率、s期占有率及p38mapk的ia值

分组	细胞凋亡率 （％，n=5）	s期细胞百分比 （％，n=4）	ia（p38mapk / β- actin, n= 10）
空白对照组	6.38±0.67	35.87±9.76	0.516±0.031
空气对照组	7.19±0.99	38.67±10.23	0.532±0.029
空气负氧离子治疗组
1h	9.07±1.07	30.12±8.87	0.598±0.048
2h	12.10±2.06＊	27.75±9.11＊	0.652±0.078＊
4h	43.35±4.56＊＃	6.11±1.45＊＃	1.78±0.231＊＃
sb203580组	9.56±0.54	26.85±6.89	0.451±0.012

注：空气负氧离子的2h、4h组与空白对照、空气对照组及sb203580组比较，t=0.029（＊p﹤0.05）；空气负氧离子4h组与1h、2h相比，t=0.031（＃p﹤0.05）。

3. 讨论

国外对空气负离子的研究比较早，开始于十九世纪五十年代。目前已经证明空气负离子有调整大脑皮质功能、改善睡眠、降低血压、加强气管粘膜细胞纤毛运动、增加基础代谢率、增进食欲、提高机体免疫力等作用。空气负氧离子浓度在达到一定程度时才具有治疗作用。研究发现，当空气负离子浓度达到700个/cm³以上时才有益于人体健康; 当浓度达到1万个/cm3以上时才能治病; 当负离子浓度大于或等于正离子浓度时, 才能使人感到舒适, 并对多种疾病有治疗作用。当空气中的阳离子含量较高时，可以增加人们的焦虑感，而负离子却可以使人放松神经和心情作用。yamada等^[5]研究认为空气负离子可以降低由高脂饮食而造成高脂血症的小鼠的红细胞的聚集作用。iwama报道^[6]空气负离子可以提高红细胞的变形能力以及有氧代谢能力。yamada等^[2] 的研究证实了空气负氧离子可以明显抑制小鼠的肿瘤的产生和扩散, 其机制与其增加小鼠体内的nk 细胞的活性相关, 其抗肿瘤作用与其吸入的时间和剂量成正比。西安医科大学、陕西省肿瘤医院选择临床晚期恶性肿瘤56例，其中肺癌30例、食管癌8例、恶性淋巴瘤10例，乳腺癌8例，随机分层抽样，实验组（吸入空气负离子加化疗）30例，对照组（单纯化疗）26例。半年后，结果显示：吸入空气负离子的实验组改善总体疗效率为93.33%，对照组为65.38%，表明吸入空气负离子的实验组总体疗效率明显高于对照组^[7]。李克亮等人^[8]的实验研究发现: 每天大量吸入空气负离子，绝大部分动物可不发生肺内转移瘤。原发瘤亦受到抑制，早期应用远高于晚期应用，但晚期应用也有一定效果。但是目前关于负氧离子对细胞水平的作用效果及机制的相关研究比较少。我们此次实验通过对体外培养的肝癌细胞观察空气负离子直接作用在细胞上所产生的生物学反应, 结果发现空气负离子可以明显诱导肝癌hepa1-6肿瘤细胞的凋亡, s期细胞在各期细胞中所占有的百分率明显下降, 同时在细胞发生凋亡时表达的磷酸化的p38mapk 明显增加, 其中以负离子作用时间4h组最为明显, 与1h和2h组相比,差异具有统计学意义( p< 0.05)。加入sb203580后在抑制了p38mapk的同时也抑制了其他一系列生物学效应。这说明空气负离子通过使细胞周期阻滞而使肿瘤细胞发生凋亡, 这种效应是通过p38mapk这条信号通路传导的。本实验结果与吉林大学第一医院的李丹等^[9]人的研究结果类似，空气负离子可以通过p38mapk信号通路明显诱导肝癌smmc-7721肿瘤细胞的凋亡，可以使s期肝癌细胞在各期细胞中所占百分率明显下降。

参考文献

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[4] 陶名章, 李慧, 陈少周,等. 人工空气负氧离子对高脂血症的临床疗效研究[j]. 中国医药导报, 2011,11(1): 10-11.

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[8] 李克亮, 赵永荃. 空气负离子抑制癌转移实验的初步报告[j]. 中国肿瘤临床, 1994,21(9): 701.

[9] 李丹, 李柏昌, 范艳艳. 空气负离子对体外培养的肝癌smmc-7721细胞的抑制作用及其相关的信号传导机制[j]. 临床肝胆病杂志, 2008,24(5): 358-360.

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* 作者简介：陶名章，男，医学博士，副主任医师，中国空气负离子暨臭氧研究学会，研究方向：人工空气负氧离子与恶性肿瘤治疗，e-mail：[email protected]。